显微术之旅

你可能在学校里用过光学显微镜。它是科学家工具箱中的一个关键仪器，我们用它来了解不到人类头发直径十分之一的样本。透过目镜，我们可以看到一个通常隐藏在视线之外的世界;充满微生物生命的生物，包含结构精美的细胞和组织。有了新的技术获得2014年诺贝尔化学奖的超分辨率荧光显微镜，我们甚至可以看到时钟装置，其中一些比光波本身还小，使细胞滴答作响。但是t到现在为止，显微镜学的历程已经很漫长了，从袖珍显微镜开始列文虎克在17世纪的荷兰……

显微镜如何分辨小特征?

那么显微镜里有什么呢?我们今天在实验室工作台上看到的显微镜包含几个关键部件:物镜、光源、目镜和样品夹。物镜是显微镜整个工作的关键。它有两个属性:放大倍率和数值孔径(物镜的分辨率)。这些依次定义了所看到的尺度。这被称为分辨率，它实际上是两点之间可以分辨的最小距离。分辨率是有限制的，因为每个点源产生的衍射图案可以相互重叠，当这种情况发生时，它使两个点源无法区分。传统光学显微镜的分辨率极限约为250纳米，也称为阿贝衍射极限。这是在传统显微镜下可以看到的最小的细节特征;所以，如果你试图在显微镜下观察小于250纳米的东西，那是不可能看到的! There are ways to get around this however and visualise biological processes on the scale of 10-250 nm, but we’ll come to that a bit later.

第一台显微镜

显微镜的出现要归功于荷兰人安东尼·范·列文虎克。1673年，他设计了一种显微镜，其中包括一颗玻璃珠作为物镜，两块黄铜板铆接在一起以固定镜头。样品被安装在一根针上，通过粗和细的运动来调整，以聚焦在样品上。这台显微镜看起来一点也不像你今天在科学实验室里看到的显微镜。列文虎克显微镜可以很容易地装进口袋里，可以随身携带，这意味着任何东西都可以被研究，这正是列文虎克所做的。他利用袖珍显微镜的这一实用性来研究各种生物标本，如血液、汗液、鱼、昆虫等许多东西。他把他的发现(幸好不是标本本身)以400封信的形式寄给了伦敦的皇家学会，并附有插图，以展示他的显微镜的能力。然而，没有人能复制他的显微镜，以及它分辨如此精细结构的能力。

事实上，列文虎克显微镜直到最近才被科学家们复制(大约350年后)。他的镜片背后的魔力和非凡的性能源于他研磨和抛光物镜。由于掌握了这项技术，他比其他显微镜学家有了优势。由于缺乏可复制的列文虎克显微镜，该复制品花了几个世纪的时间才开发出来。虽然他当时制造了几百台这样的显微镜，但今天只有大约10台幸存下来。对于那些想要看到列文虎克显微镜的人来说，可以去荷兰莱顿的布尔哈韦国家博物馆看看。

由于他的显微镜，列文虎克为科学贡献了大量的发现。然而，尽管显微镜在过去的350年里变得更加强大，技术也得到了提高，但阿贝衍射极限250纳米仍然是理解小于这个尺度的生物过程的一个限制。

为了观察更小的物体，我们需要使用不同的技术，比如电子显微镜(EM)和x射线显微镜。它们不依赖于光波，所以我们可以用它们来解析更小的结构，小到原子和分子尺度上的超高分辨率——单纳米分辨率。然而，仍有一个甜蜜点有待分析，其中发生了一系列生物过程。这个最佳点在10-250纳米左右，因此介于EM和传统光学显微镜之间，其中发生了一系列重要的过程。

荧光显微镜是将荧光探针与感兴趣的分子结合在一起，安装在显微镜上，用激光照射，获得一系列图像，以特异性地识别样品中的特定蛋白质、膜或生物分子。然而，这仍然受到光的衍射极限的限制，尽管最近有一种方法可以克服这一现象。

超分辨率显微术

它被称为超分辨率显微镜，这是一种荧光显微镜，它利用荧光探针与感兴趣的分子结合的固有特性，来解析超出光衍射极限的结构。这导致时间(时间)信息的损失，以获得生物样本的空间(空间)信息。通过这种技术，可以超越阿贝衍射极限，解析到几十纳米的结构。这种规模的生物过程的例子包括细胞内部和大脑内神经连接的组织。超分辨率显微镜使我们能够了解在纳米尺度上到底发生了什么。

这项工作的重要性在2014年得到了认可，埃里克·贝齐格、斯特凡·w·赫尔和威廉·e·莫尔纳因“超分辨荧光显微镜的发展”获得了诺贝尔化学奖。

超分辨率显微镜是一系列荧光显微镜技术的总称。其中一项引人注目的技术被称为单分子定位显微镜(SMLM)。该技术通过目标信号切换或可光切换荧光探针来切换荧光信号，以创建一系列点(定位)的图像，详细描述目标分子的结构和组织。这是一种基于点画的技术，它为你提供了传统光学显微镜无法显示的高分辨率信息。想象一下，只使用一系列相同大小的不同颜色的点来创作一幅画。这幅画需要一段时间来创作，但每个点的细节提供了更多关于这幅画的每个部分和整幅画本身的信息。

这是如何工作的呢?

显微镜的设置比传统的显微镜要复杂得多。需要一系列的组件，如:各种波长的激光线，倒置显微镜台，高放大倍率和高NA的物镜，激发和发射滤光片，相机形式的敏感探测器和许多其他设备。

基于实验室的显微镜以这种格式使用，但它的头颠倒了。你不会看到物镜俯视着样本，但样本就在物镜上。这是为了使激光波长，照亮和激发样品中的荧光探针，作为准直光束通过物镜进入。激发波长顾名思义，它激发样品内的荧光探针。探针(绑定到感兴趣的分子上——无论你在研究什么)，它们发出荧光，发出自己波长的光，称为发射波长。然后，激发光束被物镜收集，并通过一个照相机形式的探测器，在那里你会看到屏幕上出现一系列的“闪烁”。这些闪烁是荧光探针的定位和位置，标记在感兴趣的分子上，它们被激发，然后发出荧光。一系列这些定位开始慢慢地在屏幕上形成一幅图像，告诉你荧光探针的位置和它们所标记的感兴趣的分子。

这种类型的荧光显微镜可以描述如何组织，结构，或形成的一系列标记感兴趣的分子发生。这不仅局限于生物标本或样品，而且超分辨率还可以分辨凝胶中孔隙的大小，并跟踪凝胶中纳米颗粒的运动。有一个巨大的信息领域，你可以从这种类型的显微镜收集，它只需要一段时间来建立设置和图像样品!但我向你保证，结果是美丽的。

这给我们带来了什么?

显微术在过去的几个世纪里有了很大的发展。从列文虎克的显微镜到超分辨率显微镜，我们突破了光的衍射极限来了解不同尺度的样品。毫米到埃级的显微镜经过了多年的发展才达到这一阶段，但我们对尚未被理解的科学过程只了解了皮毛。这可能是一分钟的可视化，但这是一个非常令人兴奋的世界!