在这一期的eLife播客中，我们将讨论用电子进行蛋白质晶体学，二氧化碳受体的发现，对关节炎的新见解，大脑对缺失的手的反应，以及胡须的最佳形状。
在这一集里
轻轻地用在晶体学上
与弗吉尼亚州Janelia Farm研究校园的Tamir Gonen合作
非常冷的弱电子束已经被用来收集蛋白质微晶体的大量衍射图样。
Tamir -我们研究生活在细胞周围膜上的蛋白质。它们是糖和其他分子，如离子和水进出细胞的通道，我们试图研究它们是如何形成的，基于它们的形成我们试图了解它们是如何工作的，以及疾病中哪里出了问题。我们在实验室遇到的一个主要问题是，对于这种膜嵌入的蛋白质来说，形成可以推断其结构的晶体是非常困难的。所以，通常我们得到的晶体对于结构研究来说太小了。我们想要弄清楚的是，有没有别的方法可以从非常小的晶体中得到蛋白质结构?
克里斯:那么，当你在制作这些晶体或者小晶体的时候，你是如何想象它们的呢?然后你是怎么得到这个结构的?
从晶体中确定结构的最常用方法是x射线晶体学。现在，你可以把晶体想象成一个三维物体里面有重复的结构图案当你发射一束x射线穿过它时，这些重复的结构图案就像一个衍射光栅它们把x射线分开，然后以一种可预测的方式散射它们。根据你得到的散点，你可以问，什么样的结构会给我这样的图案?
克里斯-缺点是你需要大量的晶体物质才能得到可复制的图案来推断它的构成?
塔米尔:缺点是x射线有很多破坏能量，因为它是一束很强的射线。所以x射线晶体学需要大的晶体来承受我们给它的大量辐射。
克里斯-那么，你是如何试图绕过这个问题的呢?
我们尝试做的不是用x射线，而是用电子。这背后的想法是电子与物质的相互作用比x射线要好得多，所以也许我们可以使用更小的晶体。
克里斯:为什么以前没有人这么做呢?因为我们发明电子显微镜已经有几十年了，人们已经用电子显微镜对很多东西进行了非常详细的成像?那么，为什么没有人尝试做你所做的事情呢?
塔米尔:以前有人试过这么做。我的许多同事以前都把晶体放在电子束里。问题是，当人们用电子显微镜观察生物标本时，他们使用的是一种被称为低剂量冷冻电镜的程序。这意味着他们试图限制撞击样品的电子数量，因为如果太多的电子撞击样品，那么就像x射线一样，样品就会被破坏。低剂量程序将剂量限制在每平方埃约20个电子。现在，如果你拿一个晶体以每平方埃20个电子的剂量率射击，晶体在一次射击后就会被破坏。那么，我们说的是，如果单次以每平方埃20个电子的速度射击会破坏晶体，如果我们用10个电子而不是20个电子每平方埃会怎么样?我们还能得到有意义的数据吗?答案是肯定的。然后，我们变得贪婪起来，我们说，好吧，我们能再砍一点吗? And we got it down to 0.01 electrons per square angstrom per second. And so, that's about 200 times less in dose than what my colleagues were using and yet we still got meaningful data up to what is called, atomic resolution. Once we knew that we can get so much data out of a single crystal, all we had to do is that while we're exposing it, we start tilting it. And it's that tilt that gives you the different views, if you like, the different patterns from all the different angles and because you have all these different angles in three dimensions, you can calculate back and get a structure.
克里斯:你能得到什么样的图像质量呢?因为，很明显，我们可以通过x射线来了解晶体的结构。但是对于电子，除了知道晶体结构之外，你还能看到什么吗?
在x射线衍射中，你最终得到的是，电子密度图。在微电致发光中，你最终得到的是一个列势图，这意味着你可以观察电荷。所以，如果你有一个电荷偶联的过程，比如一个质子偶联的转运体，你可以计算出蛋白质中哪些氨基酸残基被保护了或去保护了。换句话说，你可以看到电荷在哪里。这将真正开始帮助你解释蛋白质工作的机制，这是x射线晶体学无法做到的。
二氧化碳传感器:如果血液太酸，你就会死
与华威大学的路易丝·梅合作
神经细胞，连接蛋白，可以检测到二氧化碳，并且可以参与各种各样的过程，比如呼吸，
听觉和生殖。
露易丝:你需要监测你血液中的二氧化碳含量。二氧化碳与水反应产生氢离子，所以它使血液变得更酸，因为酶对氢离子很敏感，如果你的血液变得太酸，你就会死。
那么，在你出现之前，科学家和医生是怎么认为二氧化碳被记录下来的呢?
路易斯:所以主要的理论是通过pH值来测量，也就是测量这些氢离子的数量。有很多证据证明这一点，这肯定是有关系的。但有更多的证据表明，二氧化碳也被直接监测，这也是我们正在研究的。
克里斯:为了做到这一点，首先，在哪里发生，其次，如何发生?
Louise -我们观察大脑，脑干中的髓质。之前的研究结果表明，如果你把pH值去掉。所以如果你保持氢离子的浓度不变而只是改变二氧化碳的浓度，你仍然会得到反应。如果你对动物这样做，它们对二氧化碳的反应仍然会增加呼吸。
所以，大脑的那个部分显然是非常敏感的，不仅对pH值敏感，而且对二氧化碳分子本身也很敏感。
露易丝-没错。
克里斯-那你是怎么做到的?
路易斯-一种叫做连接蛋白26的蛋白质，在大脑的这个区域被发现与呼吸有关。它在膜上形成孔。六个这样的蛋白质聚集在一起，形成一个半通道。所以，因为它们在大脑中与呼吸有关的区域被发现，我的小组认为它们可能与此有关。
Chris -当它们正常地在细胞上表达时-这些连接-形成这些孔，什么进出这些孔?
露易丝-所以，这是一个很大的洞。千道尔顿是穿过的物体的大小。像ATP这样的信号分子。
克里斯:那么，你认为二氧化碳是如何与这些管子相互作用的呢?
路易斯:我的小组已经证明，连接蛋白26确实会在二氧化碳的作用下打开。我要找的是一个结合点，在那里二氧化碳可以附着在通道上，使通道打开。
克里斯:在你把它作为一种假设之前，有没有什么东西是你可以看的?我们知道它以这种方式在这个环境中起作用，那么它对这个连接蛋白也起同样的作用吗?
露易丝-是的。这就是我们开始的东西。所以，我们知道二氧化碳可以通过产生氨基甲酸酯残留物与一些分子结合。所以，当二氧化碳与一种特定的氨基酸结合时，这种氨基酸被称为赖氨酸。它们存在于植物和动物中，也存在于血液中的血红蛋白中，所以我们从假设开始，这就是这里发生的事情。
克里斯-那你是怎么做到的?
露易丝:我们知道26号连接，也就是我研究的那个，对二氧化碳敏感。但我们也知道与之相关的两个连接蛋白也很敏感。它们也能吸收二氧化碳。所以，我们所做的就是把赖氨酸环化这些赖氨酸在这三种细菌中都存在，但在另一种我们知道对二氧化碳不敏感的细菌中却不存在。
克里斯-真聪明。所以，他们所做的基本上就是把你的注意力引向蛋白质的一个可能部分。那么，你如何处理这个区域来看看你是否可以欺骗那些通常对二氧化碳没有反应的细胞，让它们对二氧化碳有反应，这就证明你找到了真正的面积。
露易丝:对，没错。所以，我们所做的就是把它拿出来突变一个不敏感的连接蛋白，你想要这些残基的连接蛋白然后我们把它环到对二氧化碳敏感的连接蛋白上。正如我们所料，它变得对二氧化碳敏感。
克里斯-那么，当二氧化碳进入赖氨酸时，它是如何使通道改变其活性的呢?
路易斯-所以，我们认为这是通过我们所说的盐桥相互作用，静电相互作用。所以，当二氧化碳结合，产生新的残基时，它带一个负电荷。然后我们看半通道，这是6个这样的连接蛋白彼此相邻。在下一个连接蛋白上，有一个带正电的氨基酸，离赖氨酸很近。近到可以相互作用。所以，我们相信你最终会在亚单位之间相互作用，改变可以打开它的通道的确认。
Chris -你测试过了吗，看看这是否真的会发生我n体内或者在这个阶段，这只是一个理论?
Louise -我们做过突变研究，我们拿走了正极，并表明它阻止了通道的工作。但就动物试验而言，他们还在进行中。
克里斯:如果你已经确定了这一点，它在科学上和临床上的意义是什么?
露易丝:所以，这很令人兴奋。如果我们能确定这是二氧化碳结合位点，它使连接蛋白26成为二氧化碳受体。连接蛋白以前从未被认为是受体。因为它们有这么大的孔，这些通道的打开将允许大分子进出细胞。有一种可能性是连接蛋白可能是配体的受体，只是它们还没有被发现。
对关节炎的直觉
丹·利特曼，纽约大学
类风湿关节炎患者的肠道微生物群富含属于普雷沃氏菌属的微生物。
丹我们在老鼠身上发现，一种通常被认为是共生无害细菌的特定细菌在肠道内定植，似乎会引发一种类似类风湿性关节炎(RA)的关节炎综合征。我们只是想知道我们是否能在人类身上看到类似的东西。
克里斯:那么，你是如何进行这项研究的呢?你找来患有类风湿性关节炎的病人，然后观察是否有某些细菌在这些病人身上不断出现。
丹-没错。对存在于人体不同表面的细菌群的基因组学研究已经取得了巨大的进步。在过去的五年里，测序技术的进步使得现在一次就能拍到整个微生物群成为可能。在我们的案例中，我们观察了粪便中的微生物群，然后从每个人身上得到了这样一个序列。我相信，我们的研究之所以成功，是因为我们有机会接触到尚未接受任何治疗的患者。有些新发病的病人平均只出现了4到5个月的症状，这就是我们真正看到差异的地方。而那些尚未接受治疗的人，我们看到了他们被殖民的巨大倾向普氏菌copri。
克里斯:那么，这个普雷沃氏菌有机体，你会发现它在类风湿关节炎患者的这个群体中有过多的代表，就其物理存在和有机体的数量而言。
从数量和存在的角度来说，没错。普氏菌copri在人口中似乎呈双峰分布，特别是在西方国家。在大量的大规模研究中，无论是在美国，所谓的人类微生物组项目，HMP，还是在欧洲，有另一项大型研究叫做metaHIT研究。在这两项研究中，大约15%的健康人体内都有普雷沃氏菌。
克里斯:那么你认为它对这些患风湿性关节炎的人有什么影响呢?虫子在做什么?
丹-我们很难知道。无论是在易患类风湿关节炎的人身上，还是这些人体内的炎症有利于普雷沃氏菌的生长。这是一种可能性，但另一种可能性是这种特殊细菌的存在实际上可能有利于一种特殊类型的炎症淋巴细胞的发展这种炎症淋巴细胞可能会以某种方式攻击身体的关节。
我们也知道类风湿关节炎是家族遗传的。那么，基因在这里扮演什么角色呢?
丹:我们知道有一些特定的基因会使人易患风湿性关节炎。所以，我们观察了这些特定的基因，看看它们是否存在，我们发现令我们惊讶的是，那些有易感基因的人，实际上普雷沃氏菌的定植水平较低。所以，这是一个负相关。所以，一种解释是，需要有一个特定的阈值来激活免疫系统以触发风湿性关节炎中的自身免疫性疾病。所以，要么你有易感基因，要么你有高水平的普雷沃氏菌，但只需要其中一个就能引发疾病。
克里斯:那么，你认为要怎样才能搞定这件事呢?我们怎样才能弄清普雷沃氏菌可能扮演的角色呢?
现在重要的问题是要弄清楚普雷沃氏菌是否会引发一种免疫反应，从而导致风湿性关节炎的炎症增加。为了做到这一点，我们需要做纵向研究，跟踪那些在患病之前就有患病风险的病人，并询问我们是否可以通过改变他们的微生物群来预测疾病的发生。此外，我们还需要了解特定类型的抗生素疗法是否能够降低患病风险。另一项更机械的研究试图了解是否有特定类型的免疫细胞被普雷沃氏菌特异性激活，因为这也会给我们一个提示关于普雷沃氏菌是否通过直接激活免疫系统起作用。与此相关的问题是，像普雷沃氏菌这样的细菌是否足以启动疾病过程，之后普雷沃氏菌就不再起作用了。长期接受治疗的病人，我们没有看到普雷沃氏菌水平的增加。
皮质可塑性:大脑如何适应
与牛津大学的Tamar Makin合作
你不能教老狗新把戏，至少这是一条教条，科学家们说这是因为大脑的适应能力大大降低了
或者随着年龄的增长，塑料。但这是真的吗?牛津大学的Tamar Makin一直在研究缺乏四肢的人，试图找出……
他玛随着肢体的丧失，大脑中通常接收手部输入和输出的主要部分现在被剥夺了，这可能对人们非常有用，因为也许我们可以利用这个被剥夺的大脑区域，训练它来支持其他身体部位的行为，例如。问题是这是否可能以及大脑改变的机会是否取决于人们失去双手的年龄。
克里斯-那么，你是怎么做到的?你在研究谁?
添马舰——我们招募了几组没有手的人。一类人天生就没有手，从来没有完全发育，我们称之为先天。另一组是曾经有一只手的人，但由于创伤环境而被切掉了，这些人是后天截肢者。我们每组大约有15到20个人。我们的参与者平均年龄在45岁左右，但其中有些人很年轻，有些人20多岁，还有一些人快50岁了。
克里斯-所以，年龄范围很好。
添马舰-是的。
克里斯-你是怎么研究他们的?
塔玛:我们把他们放在核磁共振扫描仪里，让他们用不同的身体部位做一些简单的动作。通过功能性核磁共振成像，我们能够识别出当他们做这些动作时，大脑中活跃的区域。
克里斯-你看到了什么?
塔玛尔:我们看到被剥夺的大脑皮层要么被完整的手激活，也就是没有在截肢中失去并仍能正常工作的手，要么被残肢激活，也就是残缺的手臂或截肢后剩下的手臂。我们看到，被剥夺的皮层在多大程度上被运动激活，并不取决于截肢者失去手的年龄，而是取决于他们在日常生活中使用手的程度。
所以，他们把失去的手的角色转移到完整的手上的次数越多，那么提供他们失去的手的大脑区域就越容易转移到现在剩下的手上。
添马舰-没错。
克里斯:这和我们之前想的有什么不同吗?
添马舰-是的，在很多方面。我们在这项研究中发现的重要发现是，被剥夺的大脑皮层很乐意被接管。完整的手不是失去的手的皮质邻居。事实上，它在大脑的另一边。这是大脑可塑性的一个非常显著的例子——一个大脑区域被重新分配或接管去做一些新的事情。事实上，这种情况在后天截肢者中更为常见，这表明可塑性在年龄上没有上限，所以大脑是有能力改变的，即使人们已经很成年了，并且在相当长的一段时间里对那个大脑区域和特定的身体部位有过经验。
Chris -你怎么知道-只是唱反调一下-大脑中与失去的手相对应的部分的激活增强不是他们更多地使用剩下的身体部位的原因，而是他们更多地使用身体部位的原因，这样大脑的那部分就会发展到更多地与身体部位的运动相对应?
塔玛尔:这是一个很好的观点，因为当我们使用这些工具，神经成像，我们不能精确地说这是大脑的激活，形成于高强度的使用，或者更确切地说，有更多塑料大脑的人会因此选择使用他们完整的手来做出这个推断，我们实际上必须从人们失去手的第一个阶段开始。
Chris -但是，你倾向于认为是使用导致了大脑的变化，而不是大脑有能力改变更多，这使得他们更多地使用幸存的肢体部分。
塔玛:是的，我们还检查了受控参与者的大脑模式。这些是有两只手的人我们想看看那些没有失去手的人，他们的手区域的激活是否可以通过另一只手的运动来调节。比如说惯用手，当你观察非惯用手的大脑区域时，当他们移动一只手的皮层时，他们都没有显示出任何激活。所以，这让我们认为，实际上是行为驱动了可塑性，而不是反过来。
Chris，根据你的发现，这在临床上意味着什么我们应该如何让截肢者康复或者我们应该如何帮助那些天生就有肢体缺失的人?
塔玛:所以，就康复而言，我们一直认为有一个时期大脑更敏感，更有能力做出改变，那就是童年。我们的研究表明，每个人都有机会改变大脑的连接方式，以及大脑在每个年龄段的反应方式。所以，不管他们是小时候失去了手，还是天生就没有手，还是成年后失去了手，他们都应该能够利用被剥夺的大脑皮层来支持适应行为。
为什么啮齿动物有锥形胡须?
安德鲁·海尔斯，弗吉尼亚州珍妮亚农场研究校园
锥形胡须可以让生活在隧道和其他封闭空间的哺乳动物了解更多
他们的环境。
安德鲁对于老鼠来说，它们有很多胡须，它们对胡须的触觉对它们在环境中导航、发现和识别周围的物体至关重要。这些胡须的形状很特别。它们几乎是完美的锥体，这实际上给了它们很多优势，在自然环境中，老鼠可能会发现自己在那里。
克里斯-那么，你想要清除的这些胡须的最大的未知是什么?
安德鲁:我们真的很想知道为什么这些胡须是锥形的，因为所有的哺乳动物都有胡须。其他物种的胡须也有不同的形状，比如扁平的形状，或者凸起的形状。那么，老鼠的圆锥形胡须有什么特别之处，它能适应老鼠所处的环境呢?
克里斯:像地洞、洞和下水道。那么，你是如何尝试建模或测试的呢?
作为一名科学家，你要做的第一件事就是采用还原主义的方法，我们从老鼠身上取下一根胡须。把它安装在一个小棍子上，然后旋转成不同距离的物体。当我们观察到晶须如何改变形状时，根据它离物体的距离，以及我们对物体施加的力度。我们观察到的是，当锥形晶须移动到一个物体中或被推过一个物体时，有一个关键时刻，晶须会滑过物体。不是当胡须长到最顶端的时候。事实上，要快得多，我们觉得这有点出乎意料。因此，通过对这一过程的数学分析，我的合作者David Golomb意识到，晶须从物体上滑落的精确点实际上与这个圆锥形有关。
克里斯:在触须接触到多远的地方才开始发生滑动，这有关系吗?
安德鲁:当然。因此，由于胡须的尖端比底部灵活得多，当你接触胡须尖端附近的物体时，更容易发生滑动。你不需要移动胡须很远就会发生脱落。现在，如果在底部附近接触，那么你真的需要旋转晶须。须须必须在物体内部移动很长一段时间才能突然滑过。
克里斯-所以，这些测量是通过物理上安装一个须然后把它插进东西里来实现的，这就是老鼠的做法吗?
安德鲁:那么，老鼠是怎么做的呢?它们冲向一个物体，然后开始快速地前后移动它们的胡须，然后它们调整脸的方向，在物体上前后移动它们的胡须，这被称为whisking。在多次前后移动胡须的过程中，它们对物体是什么、它的位置、它的质地有了一定的了解，并利用这些来识别和定位物体。
Chris -那么，你认为考虑到你所发现的锥形轮廓的重要性，我们是否可以利用它来制造更好的传感器而不仅仅是用于老鼠?
这只是未来研究的一个有趣的方向。如果你看看任何一个走在街上的盲人，他们经常会拿着这些白色的手杖前后移动，左右拍打。他们可以试着通过用手杖击打物体来找出物体的距离，我在研究白手杖旅行时做的一件很重要的事情是，我读过一些人抱怨，例如，一根分成三部分的白手杖，与一根有锥形的统一手杖相比，缺乏同样的灵活性。我认为同样的机制也在盲人身上发挥作用，他们用白色的手杖来导航他们的环境和识别物体。所以，如果我们现在能把我们从鼠标须系统中发现的原理应用到改进白手杖的设计上，也许可以让顶端从底部到顶端有更大的灵活性梯度，那将是一件很好的事情。
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